血涂片制備與染色

血涂片是通過特定的方法將血液按一定方向均勻涂開的過程，微觀上使細胞是由球形變為平面形或近平面形平鋪在載玻片上。血涂片的顯微鏡檢查是血液細胞形態學檢查的基本步驟，特別是對于各種血液病的診斷和鑒別診斷，具有重要價值。 血涂片制備是否合格、染色的好壞直接關系到檢驗結果的質量。

（一）血涂片制備

1. 載玻片的準備

    新載玻片常帶有游離堿質，須用濃度為 lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水*沖洗，干燥后備用。舊載玻片要用含洗滌劑的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反復沖洗，zui后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥備用。使用載玻片時，不要用手觸及玻片表面，保持玻片清潔、干燥、中性、無油膩。

2.血涂片制作方法

    取血液標本一滴置載玻片的一端，以邊緣平滑的推片一端，從血滴前沿方向接觸血液，使血液沿推片散開，推片與載玻片保持 30～45 度夾角，平穩地向前推動，血液即在載玻片上形成薄層血膜(圖1—1)。

圖 2—1 血涂片的制作步驟示意圖

涂片的厚薄與血滴大小、推片與載玻片之間的角度、推片時的速度及血細胞比容有關。血滴大、角度大、速度快則血膜越厚；反之則血膜越薄。

一張良好的血涂片，要求厚薄適宜，頭體尾明顯，細胞分布均勻，血膜邊緣整齊并留有的空隙。

下面是幾種血涂片效果模式圖及形成原因 (圖l—2) 。

圖 2—2 幾種血涂片效果比較

（二）血涂片染色

染色的目的是使細胞的主要結構，如細胞膜、細胞質、細胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識別。

血涂片染色包括兩個過程：固定和染色。固定是將細胞蛋白質和多糖等成分迅速交聯凝固，以保持細胞原有形態結構不發生變化。常用的染色方法有瑞特染色法 (Wright)、姬姆薩染色法(Giemsa)等。

1.瑞特（Wright）染色法

本法的特點是將固定和染色合并在一起進行，手續簡便，染色時間短，對白細胞特異性顆粒著色較好，但對核的著色略差。

（1）瑞特染料

由酸性染料伊紅和堿性染料美藍組成的復合染料。伊紅為鈉鹽，有色部分為陰離子。美藍為氯鹽，有色部分為陽離子。美藍和伊紅的水溶液混合后，產生一種不溶于水的伊紅化美藍 (ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成為瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解離為M ＋ 和E － ，兩種有色離子可以選擇性地與細胞內不同成分結合。另一方面因其具有*的脫水作用，可將細胞瞬間固定，蛋白質被沉淀為顆粒狀或者網狀結構，表面積增加，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。

（2）緩沖液

pH6.4～6.8的磷酸鹽緩沖液，其作用是使染色環境維持在弱酸性，達到*的染色效果。

（3）細胞的著色原理

細胞的著色既有化學的親合作用，又有物理的吸附作用。不同的細胞由于其所含化學成分不一樣，化學性質各不相同，所以對染料的親合力也不一樣。

①細胞中的堿性物質與酸性染料伊紅結合染成紅色，因此，該物質又稱為嗜酸性物質。如紅細胞中的血紅蛋白及嗜酸粒細胞中的嗜酸性顆粒等與伊紅結合。

②細胞中的酸性物質可與堿性染料美藍結合而染成藍紫色，該物質又稱嗜堿性物質。如淋巴細胞胞質及嗜堿粒細胞的顆粒為酸性物質，與堿性染料美藍結合。

③中性顆粒呈等電狀態與伊紅美藍均可結合，染淡紫紅色為中性物質。另外細胞核蛋白主要由脫氧核糖核酸和強堿性的組蛋白等組成，與酸性伊紅結合染成紅色，但因核蛋白中還含有少量的弱酸性物質，與堿性美藍作用染成藍色，因含量太少，藍色反應極弱，故也被染成紫紅色。

④原始紅細胞和早幼紅細胞的胞質含有較多的酸性物質，與美藍親合力強，故染成較濃厚的藍色；隨著細胞的發育，晚幼紅細胞階段既含有酸性物質，又含有堿性物質（ Hb），既能與堿性染料美藍結合，又能與酸性染料伊紅結合，故染成紅藍色或灰紅色；當紅細胞*成熟，酸性物質*消失后，只與伊紅結合，則染成粉紅色。

圖 2－3 瑞特染色原理示意圖

（ 4）pH對細胞染色的影響

細胞著色對氫離子濃度十分敏感。細胞各種成分均由蛋白質構成，由于蛋白質是兩性電解質，所帶電荷的正負數量隨溶液 pH值而定。對某一蛋白質而言，如果環境的pH小于其等電點（PI），則該蛋白質帶正電荷即在酸性環境中正電荷增多，易與酸性伊紅結合，染色偏紅；相反，當環境的pH大于PI即在堿性環境中負電荷增多，則易與美藍結合染色偏藍。因此，要使用清潔中性的載玻片、的甲醇做溶劑和用緩沖液(pH6．4～6．8)來調節染色時的pH值，達到滿意的染色效果。

（ 5）染色效果分析

正常情況：血膜外觀呈淡粉紅色或琥珀色。顯微鏡下，成熟紅細胞呈粉紅色。白細胞胞質中顆粒清楚，并顯示出各種細胞*的色彩，細胞核染紫紅色，核染色質結構清楚。

染色偏酸：紅細胞和嗜酸粒細胞顆粒偏紅，白細胞核呈淡藍色或不著色。

染色偏堿：所有細胞呈灰藍色，顆粒深暗；嗜酸粒細胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或藍色；中性顆粒偏粗，染成紫黑色。

圖 2—4 不同染色效果的細胞比較

2.姬姆薩(Giemsa)染色法

姬姆薩染料由天青和酸性染料伊紅組成的復合染料。染色原理、緩沖液與瑞特染色法大致相同。本法對細胞核結構和寄生蟲著色較好，結構顯示更為清晰，但細胞質和顆粒著色較差。

3. 瑞－姬染色法

瑞特染色液和姬姆薩染色液對細胞進行染色時有各自的顯色特征，前者對細胞漿和顆粒著色較好，后者對對細胞核結構顯示清晰。因此將瑞特染料和姬姆薩染料混合，甲醇溶解后組成瑞－姬染色液能取長補短，優勢互補，其中所使用的緩沖液與瑞特染色法相同。用該混合染液對血細胞進行染色，細胞核、細胞漿和細胞內顆粒著色均有上佳表現，著色鮮艷，對比鮮明，是臨床上廣泛使用的方法。

（三）血涂片染色的質量控制

1．載玻片必須非常潔凈，中性，無油脂。不清潔或非中性的載玻片會造成細胞特別是紅細胞形態發生改變，導致假性的異常形態紅細胞出現。非中性的載玻片還會影響染色環境的pH值，帶油脂的載玻片會使細胞分布不均勻。

2．良好血涂片的“標準”。血膜由厚到薄逐漸過度，血膜的體尾交界部位紅細胞分布均勻，既不重疊又互相緊靠相連。

3. EDTA抗凝血液制備血涂片。由于EDTA能阻止血小板聚集，如需在顯微鏡下觀察血小板形態時可采用，但EDTA抗凝血有時能引起紅細胞皺縮和白細胞聚集，所以應根據情況恰當選擇。

4. 白細胞較低和需濃縮白細胞的標本處理。為獲得較多白細胞，可將抗凝血適當離心，使密度相同細胞集中并分層，然后取紅細胞層上薄的灰白色層（有核細胞和血小板較集中)涂片、染色。該方法非常適合于白細胞減低患者的白細胞分類計數及紅斑狼瘡細胞檢查。

5. 血細胞比容與涂片關系。血細胞比容高于正常時，紅細胞較多，血液粘度較高，用較小的角度涂片，可獲得滿意的血膜。相反，血細胞比容低于正常時，血液粘度較低，需用較大角度涂片。

6.新配制的瑞氏染液處置。新配制的瑞氏染液包括瑞－姬染液，pH偏堿，染色效果不太理想，需在室溫放置一段時間，其中美藍逐漸轉變為天青B。在密封條件下，貯存時間愈久，轉化的天青B愈多，染色效果愈好。

7.染色過深、過淺的處理。染色過深、過淺與血涂片中細胞數量、血膜厚度、染色時間、染液濃度、pH值密切相關。對于重要的標本可采用先試染的方法，根據試染效果調節第二次染色方式。糾正染色過深可縮短染色時間或稀釋染液。糾正染色過淺可延長染色時間。如果標本片有限出現了染色過深、過淺的情況，可用如下辦法挽救：染色過深可加少量緩沖液覆蓋血膜部分褪色，在顯微鏡下觀察褪色情況及時終止。染色過淺可重加染色液和緩沖液復染，也要在顯微鏡下觀察及時終止。